\documentclass{beamer}

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\title[SARTools]{Expression différentielle avec SARTools}
\author[Matthias Zytnicki]{Matthias Zytnicki, Nathalie Villa-Vialaneix \\ avec l'appui des supports de H.\ Varet et I.\ González}
\institute{MIAT INRA}
\date{31 janvier 2018}

\AtBeginSection[] {
  \begin{frame}{Plan}
		\tableofcontents[currentsection]
  \end{frame}
}


\begin{document}

\maketitle

\begin{frame}{Étapes}

	\begin{columns}
		\begin{column}{6cm}
			\begin{itemize}
				\item question biologique
				\item plan expérimental* $\dagger$
				\item extraction
				\item préparation des librairies
				\item séquençage
				\item filtrage et quantification*
				\item analyse* $\dagger$
				\item validation et interprétation*
			\end{itemize}
		\end{column}
		\begin{column}{5cm}
			\begin{itemize}
				\item *: besoins en stat
				\item $\dagger$: évoqué ici
			\end{itemize}
		\end{column}
	\end{columns}

\end{frame}


\section{Plan expérimental}

\begin{frame}{Plan expérimental}

	\begin{block}{But}
		Protocole répondant à une question donnée.
	\end{block}

	\begin{block}{En gros}
		Voir si, dans deux conditions différentes (un facteur), l'expression d'un gène change (estimer la variabilité).
	\end{block}

	\begin{block}{Moyen}
		\begin{itemize}
			\item Estimer la variabilité de votre facteur.
			\item Contrôler la variabilité des autres facteurs.
		\end{itemize}
	\end{block}

\end{frame}


\begin{frame}{Fichier de design}

	\begin{table}
		\centering
		\tt
		\begin{tabular}{cc<{\onslide<2->}c<{\onslide<3->}c<{\onslide}}
			id  & cond & day & tech. \\
			\hline
			WT1 & WT   & 1   & Alice \\
			WT2 & WT   & 2   & Bob   \\
			WT3 & WT   & 3   & Alice \\
			KO1 & KO   & 1   & Bob   \\
			KO2 & KO   & 2   & Alice \\
			KO3 & KO   & 3   & Bob   \\
		\end{tabular}
	\end{table}

\end{frame}


\begin{frame}{Ce que l'on ne fera pas ici}

	\begin{columns}
		\begin{column}{6cm}
			\begin{block}{Données pairées}
				\begin{table}
					\centering
					\tt
					\begin{tabular}{cc}
						patient & tissue \\
						\hline
						1       & normal \\
						1       & cancer \\
						2       & normal \\
						2       & cancer \\
						3       & normal \\
						3       & cancer \\
					\end{tabular}
				\end{table}
			\end{block}

			\begin{block}{Données complexes (+ rép. !)}
				\begin{table}
					\centering
					\tt
					\begin{tabular}{ccc}
						souche & stress & \\
						\hline
						A       & Y \\
						A       & N \\
						B       & Y \\
						B       & N \\
					\end{tabular}
				\end{table}
			\end{block}
		\end{column}
		\begin{column}{5cm}
			\begin{block}{Données temporelles}
				\begin{table}
					\centering
					\tt
					\begin{tabular}{cc}
						patient & heure \\
						\hline
						1       & 0h \\
						1       & 24h \\
						1       & 48h \\
						2       & 0h \\
						2       & 24h \\
						2       & 48h \\
						3       & 0h \\
						3       & 24h \\
						3       & 48h \\
					\end{tabular}
				\end{table}
			\end{block}
		\end{column}
	\end{columns}

\end{frame}


\begin{frame}{Ce que l'on ne fera jamais}

	\begin{block}{Facteurs confondants}
		\begin{table}
			\centering
			\tt
			\begin{tabular}{cccc}
				cond    & âge & tech. & lane \\
				\hline
				sain    & 21  & Alice & 1    \\
				sain    & 23  & Alice & 1    \\
				sain    & 22  & Alice & 1    \\
				sain    & 24  & Alice & 1    \\
				atteint & 54  & Bob   & 2    \\
				atteint & 52  & Bob   & 2    \\
				atteint & 53  & Bob   & 2    \\
				atteint & 51  & Bob   & 2    \\
			\end{tabular}
		\end{table}
	\end{block}

\end{frame}


\begin{frame}{Variabilité technique}
	
	\begin{block}{Importance des effets}
		\begin{itemize}
			\item Effet lane < effet flowcell < effet run $\ll$ effet biologique
			\item Le multiplexing permet toutefois de réduire les effets.
			\item L'effet librairie et multiplexing sont également très importants.
		\end{itemize}
	\end{block}
\end{frame}


\begin{frame}{Réplicats}

	\begin{block}{Pourquoi}
		\begin{itemize}
			\item Le but est d'estimer la variabilité. Elle doit donc être estimée.
			\item \og Pooler \fg\ les données ne permet d'estimer la variabilité.
		\end{itemize}
	\end{block}
	
	\begin{block}{Réplicats biologiques vs techniques}
		\begin{itemize}
			\item réplicats techniques: plusieurs mesures d'un même échantillon
				\begin{itemize}
					\item plusieurs extractions d'un même échantillon
					\item plusieurs séquençages d'une même librairie
				\end{itemize}
			\item réplicats biologiques: plusieurs mesures de la variabilité observée
		\end{itemize}
	\end{block}
	
\end{frame}


\begin{frame}{Conclusion}

	\begin{itemize}
		\item Ne vous lancez pas dans un plan que vous ne pourrez pas analyser.
		\item Parfois, plus simple, c'est mieux.
		\item Pensez comme un statisticien:
			\begin{itemize}
				\item réplication: permet d'estimer les variabilités;
				\item randomisation: diminue les biais non pris en compte dans le design;
				\item blocking: lorsque la randomisation ne permet pas de prendre en compte un effet connu, on ajoute un facteur dans le design.
			\end{itemize}
	\end{itemize}

\end{frame}


\section{Travaux pratiques}

\begin{frame}{Étape 1 --- Récupérer les données}

	\begin{block}{But}
		Récupérer les comptages pour 3 WT et 3 MT sur le génome complet.	
	\end{block}
    
	\begin{block}{Comment faire ?}
        \begin{itemize}
            \item Ouvrir un nouvel historique.
            \item Allez dans \texttt{Shared Data > Published histories}
            \item Trouvez \texttt{TP RNA-Seq --- SARTools}
            \item Sélectionnez \texttt{Import history}
            \item Choisissez le nom d'un nouvel historique qui va bien.
        \end{itemize}
	\end{block}

\end{frame}


\begin{frame}{Étape 2 --- Regrouper les données}

	\begin{block}{But}
		Créer la matrice de comptage et le plan expérimental.
	\end{block}
    
	\begin{block}{Comment faire ?}
    	Il s'agit d'entrer chaque séquençage un à un.
        \begin{itemize}
            \item Entrez un nom pour le premier groupe (de référence): \texttt{WT} 
            \item Sélectionnez le premier fichier de réplicat: \texttt{wt1.txt}
            \item Donnez-lui un identifiant: \texttt{WT1}
            \item De même pour les autres réplicats/groupe. Ajoutez des réplicats quand nécessaire.
            \item Go!
        \end{itemize}
	\end{block}

	\begin{block}{Attention}
        \begin{itemize}
            \item Souvenez-vous du nom de groupe de référence.
            \item Chaque identifiant doit être unique.
        \end{itemize}
	\end{block}
\end{frame}

\begin{frame}{Étape 3 --- Lancer l'analyse}

	\begin{block}{Comment faire ?}
    	Seuls champs importants:
        \begin{itemize}
            \item \texttt{Design/target file}: le fichier de design généré précédemment.
            \item \texttt{Zip file containing raw counts files}: les comptages générés précédemment.
            \item \texttt{Reference biological condition}: le nom du groupe de référence.
        \end{itemize}
	\end{block}

\end{frame}


\section{Exploration des données}

\begin{frame}{Pourquoi ?}

	\begin{block}{Une étape obligatoire}
		\begin{itemize}
			\item Une bonne partie des erreurs/biais peut se voir dès cette étape.
			\item On gagne du temps à chercher d'abord les problèmes.
			\item Les analyses stats ont des suppositions fortes sur les distributions des comptages, qu'il faut vérifier \textit{a priori}.
		\end{itemize}
	\end{block}

	Une analyse exploratoire prend plus de temps que l'analyse des données, mais elle est nécessaire!
		
\end{frame}


\begin{frame}{Taille de librairie}

	\begin{definition}[Taille de librairie / \textit{library size}]
		\begin{itemize}
			\item Nombre de lectures brut / normalisé d'un échantillon.
			\item Ici, le nombre de lectures sur les gènes.
		\end{itemize}
	\end{definition}

	\begin{block}{But}
		Détecter des déséquilibres dans la profondeur de séquençage.
	\end{block}
    
    \begin{figure}
    	\centering
        \includegraphics[width=5cm]{Fig/libSize.png}
    \end{figure}
		
\end{frame}


\begin{frame}{Nombre de gènes non-exprimés}

	(Ici, avec 0 lecture.)

	\begin{block}{But}
		Vérifier la distribution homogène des lectures. Détecter des biais d'amplification.
	\end{block}
		
    \begin{figure}
    	\centering
        \includegraphics[width=4cm]{Fig/nullCount.png}
    \end{figure}
		
\end{frame}


\begin{frame}{Proportion de lectures venant du gène le plus exprimé}

	\begin{block}{But}
		Détecter une contamination ou un enrichissement problématique.
	\end{block}
		
    \begin{figure}
    	\centering
        \includegraphics[width=7cm]{Fig/mostExpressed.png}
    \end{figure}
		
\end{frame}


\begin{frame}{Densité en nombre de comptages}

	\begin{block}{But}
		Vérifier une distribution homogène des lectures. Détecter des biais d'amplification.
	\end{block}
		
	\begin{block}{Visualisation}
		\begin{itemize}[<+->]
			\item Classique: un histogramme.
			\item Pour mieux visualiser, on \emph{transforme} la distribution (en $\log_2$).
			\item Plus joli (?) on donne la densité (ici, échelle log/log).
            \item On peut également utiliser des boîtes à moustaches.
		\end{itemize}
	\end{block}
		
    \begin{figure}
    	\centering
        \uncover<1->{\includegraphics[width=3cm]{Fig/histogramme.png}}
        \uncover<2->{\includegraphics[width=3cm]{Fig/histogrammeLog.png}}
        \uncover<3->{\includegraphics[width=3cm]{Fig/density.png}}
    \end{figure}
		
\end{frame}


\begin{frame}{Pairwise scatter plot}

	\begin{figure}
		\centering
        \includegraphics[width=7cm]{Fig/pairwise.png}
	\end{figure}

\end{frame}


\begin{frame}{Pairwise scatter plot}

	\begin{block}{But}
		Vérifier les corrélations d'échantillons attendues.
	\end{block}
		
	\begin{block}{Comment le lire?}
		\begin{itemize}
			\item Rectangles de la diagonale supérieure-droite:
				\begin{itemize}
					\item un carré est une comparaison de 2 échantillons A vs B,
					\item un point est un gène,
					\item absisse: $\log_2$(comptages dans A $+1$),
					\item ordonnée: $\log_2$(comptages dans B $+1$).
				\end{itemize}
			\item Rectangles de la diagonale inférieure-gauche: coefficients de SERE:
				\begin{itemize}
					\item 0: identique
					\item $\approx$1: réplicat technique
					\item $>$1: réplicats biologiques
					\item $\gg$1: autre condition
				\end{itemize}
		\end{itemize}
	\end{block}
		
\end{frame}


\begin{frame}{Coefficients SERE}

	Proposé dans Schulze \textit{et al.}, BMC Genomics. 2012.

	\begin{itemize}
		\item Avantages:
			\begin{itemize}
				\item pas sensible à la taille de la librairie,
                \item détecte des réplicats \og trop semblables\fg,
				\item plus adapté que les coefficients de Pearson ou Spearman pour le RNA-Seq.
			\end{itemize}
		\item Inconvénients:
			\begin{itemize}
				\item sensible aux forts comptages (rRNA),
				\item pas facile d'interpréter un coefficient de 5.
			\end{itemize}
	\end{itemize}
		
\end{frame}


\begin{frame}{Dendogramme}

	\begin{block}{But}
    	Agréger les données de manière non-supervisée (et comparer avec l'attendu).
	\end{block}
    
	\begin{block}{Problème}
    	La variance (attendue) \og tire\fg{} l'agrégation.
	\end{block}
    
    \visible<2->{
        \begin{block}{Solution}
            Stabiliser la variance.
        \end{block}
    }
    
    \begin{figure}
    	\centering
        \uncover<1->{\includegraphics[width=3cm]{Fig/sd.png}}
        \uncover<2->{\includegraphics[width=3cm]{Fig/sdLog.png}}
        \uncover<3->{\includegraphics[width=3cm]{Fig/sdVsd.png}}
    \end{figure}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Dendogramme}

	\begin{block}{But}
    	Agréger les données de manière non-supervisée (et comparer avec l'attendu).
	\end{block}
    
	\begin{block}{Méthode}
    	\begin{itemize}
        	\item Définir une distance en 2 échantillons: distance euclidienne ($\sqrt{\sum_g (c_{1, g} - c_{2, g})^2}$).
            \item Choix des échantillons à fusionner: méthode de Ward (la paire d'échantillons avec la plus petite distance).
    	\end{itemize}
	\end{block}
    
    \begin{figure}
    	\centering
        \includegraphics[width=4cm]{Fig/dendogram.png}
    \end{figure}
    
\end{frame}


\begin{frame}{ACP}

	\begin{block}{But}
    	Agréger les données de manière non-supervisée (et comparer avec l'attendu).
	\end{block}
    
	\begin{block}{Méthode}
    	\begin{itemize}
        	\item Représenter les comptages dans un espace à $n$ dimensions (où $n$ est le nombre de gènes).
            \item Projeter sur des axes qui maximisent la dispersion.
    	\end{itemize}
	\end{block}
    
    \begin{figure}
    	\centering
        \includegraphics[width=8cm]{Fig/pca.png}
    \end{figure}
    
\end{frame}


\section{Normalisation}

\begin{frame}{But}

    Comparer les comptages:
    \begin{itemize}
        \item deux gènes d'un même séquençage (intra-échantillons), ou bien
        \item le même gène dans deux séquençages (inter-échantillons).
    \end{itemize}

\end{frame}


\begin{frame}{Normalisation intra-échantillon}

	\begin{block}{Exemple}
    	\begin{table}
            \begin{tabular}{c|cc}
                gène & taille & nb.\ lectures \\
                \hline
                A    & 1kb    & 100           \\
                B    & 2kb    & 100           \\
            \end{tabular}
    	\end{table}
        Quel gène est plus exprimé?
	\end{block}
    
	\begin{block}{Mesures}
    	$n_A$: nombre de lectures pour le gène $A$, $N$: nombre total de lectures, $l_A$: taille de $A$.
    	\begin{itemize}
    		\item RPKM (reads per million reads per kilobase): $\frac{n_i}{\frac{N}{10^6} \times \frac{l_A}{10^3}}$
    		\item FPKM (fragments per million reads per kilobase): même chose, sauf que l'on compte les fragments (2 lectures en PE).
    		\item TPM (transcripts per million): $\frac{\frac{n_A}{l_A}}{\sum_i \frac{n_i}{l_i}} \times 10^6$.
    	\end{itemize}
	\end{block}

\end{frame}


\begin{frame}{Normalisation inter-échantillon}

	\begin{block}{Pourquoi ne pas utiliser les méthodes précédentes?}
        La taille de la librairie est \emph{une} normalisation possible.
	\end{block}
    
	\begin{block}{Exemple}
    	\begin{itemize}
            \item Imaginez les séquençages suivants:
            	\begin{itemize}
            		\item séquençage A: $n_1 = \ldots = n_{1000} = 1, n_{1001} = 1000$,
            		\item séquençage B: $n_1 = \ldots = n_{1000} = n_{1001} = 2$.
            	\end{itemize}
            \item Même nombre de lectures (ou presque). Tous les gènes sont-ils différentiellement exprimés?
		\end{itemize}	
	\end{block}

	\begin{block}{Méthode}
    	\begin{itemize}
            \item Supposer qu'un ensemble de gènes (en général, la majorité) des gènes n'est pas différentiellement exprimé.
            \item Appliquer un coefficient multiplicatif par échantillon pour que ces gènes aient les mêmes comptages.
		\end{itemize}	
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Normalisation inter-échantillon --- DESeq2}

	\begin{block}{Méthode}
      \begin{itemize}[<+->]
          \item Définir une expression moyenne pour chaque gène (moyenne géométrique): $r_g = (\Pi_i c_{g, i})^{1/N}$
          \item Comparer chaque expression par rapport à la moyenne: $\tilde{c}_{g, i} = \frac{c_{g, i}}{r_g}$
          \item Trouver le coefficient moyen: $s_i = med_g(\tilde{c}_{g, i})$
          \item Appliquer les coefficients: $c_{g, i}' = c_{g, i} \times s_i$
      \end{itemize}
	\end{block}
    
    \begin{figure}
    	\centering
        \only<1>{\includegraphics[width=5cm]{Fig/RLE_Norm_02.pdf}}
        \only<2>{\includegraphics[width=5cm]{Fig/RLE_Norm_03.pdf}}
        \only<3>{\includegraphics[width=5cm]{Fig/RLE_Norm_04.pdf}}
        \only<4>{\includegraphics[width=5cm]{Fig/RLE_Norm_05.pdf}}
    \end{figure}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Normalisation inter-échantillon --- DESeq2}

	\begin{block}{Hypothèse}
    	Cela suppose que les valeurs $\tilde{c}_{g_i}$ sont plutôt symétriques. Idéalement, la médiane est également le mode.
	\end{block}

	\begin{block}{Vérification}
        \begin{figure}
            \centering
            \includegraphics[width=8cm]{Fig/sizeFactor.png}
        \end{figure}
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Normalisation inter-échantillon}

	\begin{block}{Corrélation entre facteurs de normalisation et taille de librairie}
        \begin{figure}
            \centering
            \includegraphics[width=6cm]{Fig/sizeFactorVsnReads.png}
        \end{figure}
        Notez qu'il n'y a pas toujours corrélation évidente.
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Vérification de la normalisation}

	\begin{block}{But}
    	Vérifier que les distributions sont maintenant relativement similaires.
	\end{block}

    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=9cm]{Fig/counts.png}
    \end{figure}
    
\end{frame}


\section{Test}

\begin{frame}{Données}

	\begin{block}{Ce que l'on a}
		\begin{table}
			\tt
			\centering
			\begin{tabular}{c|ccc}
				gene\_id & cond1\_rep1 & cond1\_rep2 & \ldots \\
				\hline
				gene\_A  & 12          & 14          &        \\
				gene\_B  & 42          & 56          &        \\
				gene\_C  & 0           & 0           &        \\
			\end{tabular}
		\end{table}
		et un design expérimental.
	\end{block}

	\begin{block}{Ce que l'on veut}
		Connaître les gènes différentiellement entre les 2 conditions.
	\end{block}

\end{frame}


\begin{frame}{Méthode}

    \begin{columns}
        \begin{column}{5cm}
            \begin{block}{Modèle}
                L'expression est modélisée par une loi paramétrique.
            \end{block}
        \end{column}
        \begin{column}{5cm}
            \begin{figure}
                \centering
                \includegraphics[width=2cm]{Fig/law.png}
            \end{figure}
        \end{column}
    \end{columns}

	\begin{block}{Hypothèse nulle}
    	Le gène $g$ n'est pas différentiellement exprimé.
	\end{block}
    
    \begin{columns}
        \begin{column}{5cm}
            \begin{block}{Fitting}
                Les paramètres sont estimés.
            \end{block}
        \end{column}
        \begin{column}{5cm}
            \begin{figure}
                \centering
                \includegraphics[width=3cm]{Fig/fitting.png}
            \end{figure}
        \end{column}
    \end{columns}

	\begin{block}{Statistique}
    	Une statistique quantifie la différence dont la loi sous l'hypothèse nulle est connue.
	\end{block}
    
	\begin{block}{Test}
    	Le test dit si l'on peut rejeter l'hypothèse nulle ou pas à un seuil donné.
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Modèle}

	\begin{block}{Correspondance}
		\begin{table}
			\begin{tabular}{c c}
				Données              & Modèle                  \\
				\hline
				DNA extrait et clivé & urne avec des boules    \\
				séquençage           & sélection de $N$ boules \\
				gène $A$             & boule avec marqué $A$   \\
			\end{tabular}
		\end{table}
	\end{block}

	\begin{columns}
		\begin{column}{5cm}
            \begin{block}{Question}
                \begin{itemize}
                    \item J'ai 3 tirages.
                    \item J'ai tiré 42, 45 et 56 boules $A$ sur 1M de boules au total.
                    \item Combien y avait-il de boules $A$ dans l'urne?
                \end{itemize}
            \end{block}
		\end{column}
		\begin{column}{5cm}
            \begin{block}{Réponse}
                \begin{itemize}
                    \item $\mu_A$: proportion de $A$.
                    \item 1 tirage: loi de Bernoulli de loi $\mu_A$.
                    \item $N$ tirages: le nombre de boules $A$ suit une loi Binomiale $(N, \mu_A)$.
                    \item $\approx$ loi de Poisson $(N \mu_A)$.
                \end{itemize}
            \end{block}
		\end{column}
    \end{columns}

\end{frame}


\begin{frame}{Binomiale négative}

	\begin{block}{Problème}
		La moyenne et la variance d'une loi de Poisson sont identiques.
	\end{block}
    
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=5cm]{Fig/overdisp.jpg}
        {\scriptsize Anders \& Huber, BMC Gen.\ Biol., 2010}
    \end{figure}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Binomiale négative}

	\begin{block}{Définition}
		La binomiale négative $BN$ a deux paramètres:
        \begin{itemize}
			\item la moyenne $\mu$,
			\item le paramètre de dispersion $\alpha$,
        \end{itemize}
        à estimer.
	\end{block}
    
    
	\begin{block}{Hypothèse nulle}
    	La moyenne de l'expression du gène $A$ dans les conditions 1 et 2 est identique.
        
        \[ \mu_{A1} = \mu_{A2} \]
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Binomiale négative --- dispersion}

	\begin{block}{Effet de la dispersion}
        \begin{figure}
            \centering
            \includegraphics[width=7cm]{Fig/overdispEffect.png}
        \end{figure}
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Estimation de la dispersion}

	\begin{block}{Méthode}
		Par défaut, DESeq2 estime la relation moyenne/variance par un tendance qui peut être choisie comme linéaire ou bien \og arbitraire \fg{} (LOESS, lissage local).
	\end{block}
        
	\begin{block}{But}
    	Vérifier que la relation est bien estimée.
	\end{block}
    
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=5cm]{Fig/dispersion.png}
    \end{figure}


\end{frame}


\begin{frame}{p-valeur}

	\begin{block}{Définition}
		La p-valeur est la probabilité d'observer un élément au moins aussi extrême, sous l'hypothèse nulle.
	\end{block}

	\begin{block}{Ce n'est pas}
		la probabilité que l'hypothèse nulle soit vraie.
	\end{block}
    
	\begin{block}{Intérêt}
		Proposer une quantification dans le choix du rejet de l'hypothèse nulle (contrôler le risque de rejeter l'hypothèse nulle à tord).
	\end{block}

	\begin{block}{Remarques}
      \begin{itemize}
          \item La p-valeur peut être déduite de la loi modélisant l'hypothèse nulle et des observations.
          \item Un seuil de $5\%$ ou $1\%$ est simplement une convention.
      \end{itemize}
	\end{block}

\end{frame}


\begin{frame}{Distribution des p-valeurs}

	\begin{block}{But}
		Vérifier que le test s'est correctement réalisé.
	\end{block}
        
	\begin{block}{Méthode}
    	\begin{itemize}
    		\item Sous l'hypothèse nulle, la distribution des p-valeurs est uniforme sur $[0, 1]$.
    		\item Les gènes différentiellement exprimés doivent avoir une p-valeur proche de $0$.
            \item[$\Rightarrow$] La distribution doit être un mélange des deux précédentes distributions.
    	\end{itemize}
	\end{block}
    
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=3cm]{Fig/pvalues.png}
    \end{figure}

\end{frame}


\begin{frame}{Comment se tromper}

	\begin{block}{Deux types d'erreur}
		\begin{tabular}{c c | c c}
                                      &             & \multicolumn{2}{c}{vérité} \\
			                          &             & diff.\ exp. & non diff. exp. \\
            \hline
            \multirow{2}{*}{décision} & détecté     & OK          & type I          \\
                                      & non-détecté & type II     & OK \\
		\end{tabular}
	\end{block}
        
	\begin{block}{Remarque}
    	Accepter l'hypothèse nulle lorsque p-valeur $\leq \alpha$ revient à contrôler l'erreur de type I au seuil $\alpha$.
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Tests multiples}

	\begin{block}{Exemple}
    	Expression d'un gène dans des populations sauvages et mutantes.
        \begin{table}
        	\centering
            \begin{tabular}{c c c c c c c c c c c c}
                \multicolumn{12}{c}{sauvages} \\
                10 & 20 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 40 & 50 \\
                \hline
                \multicolumn{12}{c}{mutants} \\
                10 & 20 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 30 & 40 & 50 \\
            \end{tabular}
        \end{table}
        
        On échantillonne (au hasard) les populations:
        \begin{itemize}
            \item Si l'on prend 30, 30, 30 vs 30, 30, 30: pas d'expression différentielle.
            \item Si l'on prend 10, 20, 30 vs 30, 40, 50: expression différentielle.
        \end{itemize}
	\end{block}
        
	\begin{block}{Conclusion}
    	On a toujours une chance de trouver des gènes différentiellement exprimés (par hasard).
	\end{block}
    
\end{frame}


\begin{frame}{\textit{Spurious correlation}}

	\begin{figure}
		\centering
        \includegraphics[width=10cm]{Fig/spurious.png} \\
        \texttt{http://tylervigen.com}
	\end{figure}
    
\end{frame}


\begin{frame}{Correction des tests multiples}

	\begin{block}{But}
		Contrôler le FDR (false positive rate), le nombre d'erreurs de type I, sur l'ensemble des tests.	
	\end{block}

	\begin{block}{Méthode}
		Algorithme de Benjamini--Hochberg donnant des p-valeurs ajustées.
	\end{block}
    
\end{frame}



\begin{frame}{MA-plot}

	\begin{block}{But}
		Observer les tendances de différence d'expression.
	\end{block}
        
	\begin{block}{Méthode}
    	Un point est un gène:
    	\begin{itemize}
    		\item abscisse: moyenne (A)
    		\item ordonnée: log-ratio (M)
    	\end{itemize}
        Les points rouges sont les gènes différentiellement exprimés. Les points rouges et noirs peuvent se superposer.
	\end{block}
    
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=3cm]{Fig/maplot.png}
    \end{figure}

\end{frame}


\begin{frame}{Volcano plot}

	\begin{block}{But}
		Observer les tendances de différence d'expression.
	\end{block}
        
	\begin{block}{Méthode}
    	Un point est un gène:
    	\begin{itemize}
    		\item abscisse: log-ratio
    		\item ordonnée: p-valeurs
    	\end{itemize}
        Les points rouges sont les gènes différentiellement exprimés.
	\end{block}
    
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=3cm]{Fig/volcano.png}
    \end{figure}

\end{frame}

\end{document}
